Novice in obvestila

V junijski številki revije Nature genetics (IF 41,379) ste kot del mednarodnega konzorcija za genetiko kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB) objavili članek o genetiki bolnikov s KVČB, ki imajo evropsko ali vzhodnoazijsko poreklo (Genetic architecture of the inflammatory bowel diseases across East Asian and European ancestries). Kako je prišlo do nastanka študije in članka? Kako sta potekala organizacija študije in nastajanje članka?

V Mednarodnem konzorciju za genetiko kronične vnetne črevesne bolezni (International Inflammatory Bowel Diseases Genetic Consortium – IIBDGC), ki ga sestavljajo vodilne skupine na področju genetike kompleksnih bolezni iz najuglednejših svetovnih univerz in inštitutov, kot so Harvard, MIT, Yale, Cambridge, Oxford, Karolinska in Wellcome Trust Sanger Institute, sodelujemo že od leta 2010, ko smo sodelovali v projektu iCHIP. Z njim smo odkrili 163 s KVČB povezanih lokusov (genov) in s tem opisali genetsko arhitekturo KVČB, kar je takrat predstavljalo tudi najpodrobnejši opis genetskega dejavnika tveganja za katerokoli kompleksno bolezen. Za to študijo, objavljeno v Nature (2012;491(7422):119-24), smo prispevali genotipske podatke za slovenske bolnike s KVČB, pridobljene z mikromrežo (biočip). Genotipizacijo slovenskih bolnikov za to študijo smo opravili pri konzorcijskem partnerju na Nizozemskem, ker takrat v Sloveniji še nismo imeli tehnologije za genotipizacijo z mikromrežami, ki omogoča sočasno analizo več sto tisoč polimorfizmov posameznega nukleotida (SNP – single nucleotide polymorphism) in t.i. asociacijsko analizo v celotnem genomu (GWAs – genome wide associacion study). V nadaljevanju smo v okviru konzorcija IIBDGC sodelovali pri številnih nadaljnjih genetskih študijah, vključno z najnovejšo že omenjeno študijo, kjer smo poleg evropskih bolnikov vključili tudi bolnike s KVČB z vzhodnoazijskim poreklom. Genotipizacijo slovenskih bolnikov s KVČB za to študijo smo izvedli v svojih laboratorijih Centra za humano genetiko in farmakogenomiko na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru (MF UM), saj smo že pred časom pridobili najsodobnejšo tehnologijo mikromrež, ki omogoča sočasno genotipizacijo do enega milijona polimorfizmov SNP v celotnem genomu. Po pridobitvi genotipskih podatkov smo izvedli bioinformatske analize pri slovenskih bolnikih in pripravili set genotipskih in kliničnih podatkov v formatu, ki je omogočil skupne nadaljnje konzorcijske analize. V zadnjem času je tehnologija za genotipizacijo v celotnem genomu postala tako tehnično kot cenovno dostopnejša, tako da za genetske kompleksne bolezni analize posameznih genov skoraj niso več smiselne. Pri tem je seveda treba upoštevati, da ogromna količina podatkov, ki jih ustvari genotipizacija z mikromrežami, zahteva tudi kompleksne bioinformatske in statistične analize. V naši skupini smo predhodno potrebovali kar nekaj časa, da smo razvili ustrezne bioinformatske ekspertize, ki nam že nekaj časa omogočajo, da lahko v celoti samostojno izvedemo GWAs-analize in/ali sodelujemo v študijah v mednarodnih genetskih konzorcijih. 

KVČB je, imunološko gledano, poligenska avtovnetna bolezen, kar pomeni raznolike funkcionalne posebnosti proteinov, ki so vpleteni v uravnavanje vnetja. Ker je črevo najbolj izpostavljena telesna bariera, se v uravnavanje lokalnega vnetja vpletajo še številne molekularne lastnosti črevesnega epitelija, sluzi, pa seveda tudi mikrobiote in prehrane. Zaradi raznolikih dejavnikov pri razvoju KVČB se je razumevanje patogeneze te bolezni dolgo vrtelo okoli patohistoloških slik vnetja, ki jim ni bilo mogoče najti jasnega molekularnega mehanizma. Tudi imunološke analize niso dale prave razlage, dokler ni prišla genetika. In tudi pri tem ne genetika posamičnih bolnikov, kot smo vajeni npr. pri imunskih deficitih, ampak populacijska genetika. Kako je potekala zgodovina genskega odkrivanja KVČB, ki je tudi vaša strokovna stalnica?

Odkritje 163 genov, povezanih s KVČB, s katerim smo v že omenjeni študiji iz leta 2012 razkrili temeljno genetsko arhitekturo KVČB, je omogočilo bioinformatsko analizo molekularno-genetskih mrež vzporednega izražanja in razvrščanja genov v hierarhične skupine po funkcijski podobnosti (genska ontologija). Na osnovi te analize smo ugotovili, da je večina genov in bioloških poti, po katerih poteka patogeneza te bolezni, enakih tistim, ki jih celice uporabljajo za odziv na okužbo z mikrobi. To nakazuje, da so na evolucijski razvoj genetske nagnjenosti za KVČB močno vplivale prejšnje okužbe z mikrobi. Mnogi od 163 genov so vključeni v molekularne funkcije, ki so bile pričakovano povezane s patogenezo KVČB, kot so zagotavljanje integritete črevesnega epitelija in sluznice, regulacija imunske funkcije in odziv na mikrobe, presenetljiva pa je bila ugotovitev velikega števila genov, ki regulirajo avtofagijo.

Študija pa je prinesla tudi druge presenetljive ugotovitve in odprla številna nova vprašanja, ki so klicala po nadaljnjih študijah v okviru konzorcija. Ena bolj presenetljivih ugotovitev je bila, da se 82 % polimorfizmov SNP, povezanih z boleznijo, nahaja v nekodirajočih območjih gena ali celo v »genskih puščavah«. Z nadaljnjimi študijami smo za 48 % teh nekodirajočih polimorfizmov, povezanih z boleznijo, dokazali povezavo s področji, ki zadevajo uravnavanje izražanja genov. Presenetljiva je bila tudi ugotovitev, da smo kljub analizi celotnega genoma in odkritju kar 163 genov, povezanih s KVČB, uspeli pojasniti samo ~20 % dednega dejavnika za KVČB. Z nadaljnjimi raziskavami, v katerih smo podrobneje sekvencirali gene v bližini z boleznijo povezanih polimorfizmov, smo v nekaterih KVČB-lokusih odkrili redke vzročne mutacije v kodirajočem delu genov, ki so v genetskem neravnovesju s polimorfizmi SNP, povezanimi s KVČB, in na ta način vsaj delno potrdili eno od možnih razlag »manjkajoče dednosti«. Genomske analize ne pomagajo samo pri razumevanju molekularne patogeneze, ampak so izsledki tudi klinično uporabni. Tako smo v nadaljnjih genomskih raziskavah KVČB v okviru konzorcija z analizo povezav genotipov in kliničnih podatkov bolnikov ugotovili, da se Crohnova bolezen (CB) z vnetim debelim črevesom in Crohnova bolezen z vnetim tankim črevesom genetsko razlikujeta skoraj v enaki meri kot Crohnova bolezen in ulcerozni kolitis (UC). Na osnovi tega smo predlagali, da se dosedanja tradicionalna razdelitev KVČB na dva glavna podtipa (Crohnova bolezen in ulcerozni kolitis) razširi na tri enakovredne podtipe: ulcerozni kolitis, Crohnova bolezen z vnetim debelim črevesom in Crohnova bolezen z vnetim tankim črevesom. Naši rezultati so tudi pokazali, da je 113/163 (69 %) genetskih lokusov, povezanih s KVČB, povezanih tudi z eno ali več drugimi kroničnimi imunskimi boleznimi, kar nakazuje, da imajo različne kronične imunske bolezni skupne številne molekularnobiološke procese. Pred kratkim smo naredili primerjavo 240 genov, povezanih s kompleksno obliko KVČB (z nadaljnjimi genetskimi študijami smo poleg prvotnih 163 odkrili dodatnih 77 novih KVČB-genov), in 85 genov, povezanih z monogenskimi sindromi pri otrocih s simptomi, podobnimi KVČB. Prišli smo do zanimive ugotovitve, da je samo 7 genov skupnih, nekaj več podobnosti (13 %) pa smo ugotovili pri primerjavi terminov genske ontologije, vključno molekularnobioloških poti, pri čemer pa je bila primarna imunodeficienca izrazito povezana predvsem z monogensko obliko pri otrocih. Podobni rezultati genetskih študij pri večini drugih boleznih so privedli do novega koncepta v medicini, kjer posamezne bolezni ne delimo več na podtipe samo po kliničnih znakih in parametrih, ampak vse bolj tudi na osnovi molekularnih endotipov, ki jih določamo s pomočjo molekularnogenetskih biooznačevalcev.

Kateri geni in njihovi produkti so zdaj že jasno vpleteni v nastanek in razvoj KVČB in kako izgleda molekularna patogeneza z vidika genetika?

Do uveljavitve asociacijske analize v celotnem genomu so študije posameznih kandidatnih genov odkrile številne kandidatne gene, povezane s KVČB, ki pa se niso potrdili v neodvisnih študijah. Glede na to, da ima genetski dejavnik večji vliv pri CB kot pri UC, je tudi pomen genov bolj raziskan pri CB. NOD2/CARD15 je bil prvi gen, ki se je potrdil v številnih neodvisnih študijah kot dejavnik tveganja za CB, kar pa ni presenetljivo, saj njegov prispevek k tveganju (OR>3) nekoliko odstopa od preostalih genov. Gen NOD2/CARD15 je v celici odgovoren za prepoznavo bakterijskih peptidov ob okužbi z bakterijo in aktivaciji apoptoze preko signalne poti NFκB. Mutiran NOD2 verjetno tudi deregulira avtofagijo, ki se sproži ob okužbi z bakterijo. Šele GWAs-analize so zanesljivo potrdile dodatne gene, od katerih ima posamezni gen samo manjši prispevek (OR<2) k celotnemu genetskemu tveganju za KVČB. Med pomembnejšimi geni je gen ATG16L1 in ostali geni, ki regulirajo proces avtofagije: IRGM1, LRRK2 in gen ATG5, kar še dodatno potrjuje pomen avtofagije v CB. Zelo pomembna sta gena IL23 in IL23R in signalna pot preko receptorja IL-23R. Povečana proizvodnja IL-23 lahko povzroči povečan odziv Th17 po več poteh, vključno z ILC in celicami CD4+ T preko receptorja IL-12Rb1/IL-23R. Natančna povezava med NOD2 in IL-23 signalno potjo še ni povsem jasna, verjetno aktivacija NOD2 z bakterijskimi peptidi vpliva na prirojeni imunski sistem, vključno z zaviranjem učinkov citokinov (npr. odzivov Th17, ki jih povzroča IL-23), zaviranjem drugih receptorjev za prepoznavo molekularnih vzorcev (npr. odzivov TLR2 in TLR4) in indukcijo tolerance (preko IL-10 in zmanjšanega TGFb). IL-23 zavira tudi odzive celic Treg/IL-10, ki so odgovorne za homeostazo sluznice, in ima zaviralni učinek na celice B, celice T in monocite. Molekularna patogeneza CB je kompleksna in potrebne bodo še številne funkcijske študije, da bodo pojasnile vlogo posameznih genov, katerih povezava s CB je bila ugotovljena z GWAs, in povezanih molekularnobioloških poti pri nastanku CB.

Kako poteka pridobivanje in analiza podatkov pri genomskih asociacijskih študijah?

Asociacijska študija v celotnem genomu (GWAs) se izvaja z genotipizacijo polimorfizmov SNP z mikromrežami pri skupini bolnikov in kontrolni skupini zdravih posameznikov, kjer se primerja pogostnost alela (različice gena) med obema skupinama (študija primeri : kontrole). Alelu, ki je pogostejši pri bolnikih, predstavlja rizični alel. Bioinformatska analiza se začne s kontrolo kakovosti genotipskih podatkov, pridobljenih z mikromrežo, kjer se najprej izločijo nezanesljivi podatki (premajhna zanesljivost poklicanega genotipa), preiskovanci in polimorfizmi SNP s preveč manjkajočimi podatki, polimorfizmi s prenizko pogostnostjo v populaciji, preveri se tudi morebitna sorodnost preiskovancev. V nadaljevanju se izvede imputacija genotipov, kjer se cca milijon določenim genotipom vsakemu posamezniku doda cca do 10 milijonov genotipov. Imputacija temelji na principu genetskega neravnovesja (linkage disequilibrium – LD), kar pomeni, da se aleli polimorfizmov SNP, ki so umeščeni blizu (običajno do 250 kbp) na istem kromosomu, dedujejo vezano na istem haplotipu (jih dobimo od istega starša) in zato lahko z visoko verjetnostjo izračunamo, kakšen genotip ima posameznik na bližnjih polimorfizmih SNP v LD, brez da bi te polimorfizme SNP dejansko genotipizirali, kar nam omogoča boljšo resolucijo brez dodatnih stroškov genotipizacije. Genetsko ravnovesje pa ima tudi negativni učinek, saj lahko z asociacijsko študijo z boleznijo povežemo skupino polimorfizmov SNP, ki se dedujejo povezano (»v paketu«), ne moremo pa enostavno določiti, kateri izmed SNP je vzročni. Glede na to, da takšen haplotipski blok obsega več deset polimorfizmov SNP, ki so razporejeni na razdalji več 100 kbp na kromosomu, kjer se lahko nahaja tudi več genov in medgenskih sekvenc, je dostikrat izziv določiti, kateri gen je vpleten v bolezen, kar je pomembno tudi za nadaljnje funkcijske analize in analize bioloških poti. Eden najučinkovitejših postopkov je analiza eQTL, kjer ugotavljamo učinek alela na izražanje (ekspresijo) sosednjih genov. Končni rezultat GWAs-analize se prikaže s t.i. grafom Manhatten, kjer je za vsak SNP ovrednotena statistična razlika v frekvenci manj pogostega alela (MAF) med bolniki in zdravimi posamezniki, pri čemer se upošteva kot statistično zanesljiva povezava pri vrednosti p<10^-8.

Izjemnost objavljene študije je zajem velikih skupin bolnikov in kontrol, kar je pri tako poligenski bolezni, kot je KVČB, pogoj za statistično utemeljeno povezavo najdenih genskih posebnosti z boleznijo. Katere genske posebnosti so v študiji najznačilneje korelirale z nastankom KVČB in kaj je pokazala primerjava med bolniki, ki imajo evropsko ali vzhodnoazijsko poreklo?

V študijo je bilo vključenih 400.000 preiskovancev, od tega 30.000 (15.000 bolnikov s KVČB, 15.000 kontrol) preiskovancev vzhodnoazijskega (VA) porekla in 370.000 (30.000 bolnikov s KVČB in 340.000 kontrol) preiskovancev evropske populacije (EU). Skupna GWAs-analiza v obeh populacijah je odkrila 81 novih KVČB-genov in povečala skupni seznam KVČB-genov na 320. Vključitev do sedaj slabo preučevane vzhodnoazijske populacije je pomembno prispevala k odkritju predvsem tistih novih genov (npr. ADAP1 in GIT2), v katerih v evropski populaciji ni variabilnosti (polimorfizmov SNP) oz. je frekvenca manj pogostega alela v evropski populaciji prenizka, da bi dosegli zadostno statistično moč in z GWAs-študijo potrdili povezavo. Prispevek genetskega dejavnika k nastanku KVČB in sama genetska arhitektura obeh populacij sta razmeroma podobna pri EU- in VA-populaciji, pri čemer so razlike nekoliko večje pri CB kot UC. Razlike so predvsem pri pomembnosti posameznih genov, npr. najpomembnejša gena pri nastanku CB v EU-populaciji NOD2 in ATG16L1 imata v VA-populacijo samo manjšo vlogo, ker je v VA-populaciji nižja frekvenca z boleznijo poveznih SNP, npr. trije najpomembnejši SNP v NOD2 imajo v EU-populaciji skupno alelno frekvenco 13 %, v VA-populaciji pa manj kot 0,1 %. Na drugi strani se je izkazal kot najpomembnejši gen za nastanek CB v VA-populaciji gen TNFSF15, ker ima precej večji učinek na povečanje tveganja za CB (višje OR-razmerje obetov) v VA-populaciji kot v EU-populaciji. Med novoodkritimi geni pa obstajajo seveda tudi posamezni geni, ki prispevajo k genetskemu dejavniku za nastanek KVČB samo v VA-populaciji, npr. gen CS2RB. Študija je tudi pokazala večjo zanesljivost poligenskega izračuna tveganja (polygenic risk score – PRS) v VA-populaciji, če so bili v izračun PRS vključeni najpomembnejši geni v VA-populaciji. To nakazuje, da PRS napovedni model, ki je izračunan na podlagi podatkov v EU-populaciji, ni enostavno prenosljiv v populacije z drugačnim etničnim poreklom, kar ima pomembne implikacije pri uporabi genetskih napovednih modelov v klinični praksi.

Kakšni so organizacijski pogoji, ki v določeni državi oz. njenem zdravstvenem sistemu omogočajo pridobivanje podatkov za kakovostne genomske študije? Kje smo pri nas, kaj so primeri dobre prakse?

V Sloveniji je poleg našega še več posameznih laboratorijev in kliničnih oddelkov, ki imamo bogate izkušnje s sodelovanjem v mednarodnih multicentričnih genomskih študijah in poskušamo pridobljene dobre prakse prenesti in čim bolj sistematično urediti ter razširiti v slovenski prostor. Tako v Sloveniji obstaja več ciljnih raziskovalnih projektov, predvsem na področju redkih dednih bolezni (npr. Analiza in razvoj področja redkih bolezni v Sloveniji, Slovenski genomski projekt) in nacionalnih vozlišč, vključenih v mednarodne infrastrukturne mreže (npr. Elixir-SI za urejanje genomskih podatkov, EATRIS-TRI.si za razvoj raziskovalne infrastrukture za mednarodno konkurenčnost slovenskega RRI-prostora na področju biomedicine in razvoja zdravil ter BBMRI.SI za razvoj infrastrukture za biobančništvo in biomolekularne vire). V okviru nacionalnega vozlišča BBMRI.SI (član mednarodne mreže BBMRI-ERIC (Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure - European Research Infrastructure Consortium)), kjer je Univerza v Mariboru koordinator, sam pa sem predsednik upravnega odbora, tako skupaj s partnerji iz vse Slovenije (Univerza v Ljubljani, Univerza na Primorskem, Univerzitetni klinični center Maribor) pomagamo vzpostaviti enotne standardne operativne postopke za odvzem, hranjenje in procesiranje kliničnih vzorcev in izoliranih biomolekul, organizacijo in digitalizacijo kliničnih in genomskih podatkov ter zagotavljanje evropskih etičnih, pravnih, socialnih, varnostnih in kakovostnih normativov biobank z namenom pospešiti temeljne in translacijske biomedicinske raziskave v slovenskem prostoru. Želimo tudi izboljšati medinstitucionalno sodelovanje in možnosti slovenskih raziskovalnih institucij in podjetij pri vključevanju v mednarodne konzorcije za biomedicinske raziskave in pridobivanje EU-financiranja. 

Poleg razjasnitve patogeneze KVČB se genske analize izkažejo za uporabne tudi kot pomoč pri izbiri terapije. Tudi to je tema precejšnjega števila vaših objav – kako lahko genomika že danes pomaga pri personalizaciji terapije za obvladovanje KVČB in kje smo v Sloveniji glede tega?

Biološka zdravila so v zadnjem času močno povečala uspešnost zdravljenja tudi najtežjih oblik KVČB, pri katerih bolniki kažejo neodzivnost ali neželene učinke na standardna zdravila, kot so aminosalicati, imunosupresivi in kortikosteroidi. Prvo biološko zdravilo pri zdravljenju Crohnove bolezni so bili zaviralci TNFα (infliksimab, adalimumab). V zadnjem času postajajo z razpoložljivostjo biosimilarjev biološka zdravila vse dostopnejša, pojavljajo pa se vedno nova biološka zdravila tudi za zdravljenje KVČB, vključno zaviralci IL12/IL23 (ustekinumab) in integrinov (vedolizumab). Žal pa tudi vsa biološka zdravila niso enako učinkovita pri vseh bolnikih, kar kliče po odkrivanju biooznačevalcev za personalizirano uporabo bioloških zdravil pri KVČB. Pri neodzivnosti na biološka zdravila opažamo primarno neodzivnost, ki se pokaže kmalu po uvedbi terapije, in neodzivnost, ki se pojavi šele sčasoma po več tednih ali mesecih pri bolnikih, ki se v začetku dobro odzivajo, potem pa učinkovitost pada. To neodzivnost lahko pripišemo pojavu protiteles proti biološkemu zdravilu, primarno neodzivnost pa različni molekularni patogenezi. Biološka zdravila delujejo tarčno na določene signalne poti, zato z veliko verjetnostjo sklepamo, da obstajajo podskupine bolnikov s KVČB z značilno molekularno patogenezo, t.i. molekularni endotipi, pri katerih igrajo pomembno vlogo točno določene signalne poti. Naloga raziskav personalizirane medicine je, da razdelimo bolnike glede na njihove »molekularne podpise«, t.i. molekularne endotipe, ki se najučinkoviteje zdravijo s točno določenim biološkim zdravilom. V naših raziskavah smo do sedaj največ časa posvetili odkrivanju genov, bioloških poti in molekularnih mehanizmov (ne)odzivnosti na adlimumab pri bolnikih s Crohnovo boleznijo. Trenutno se kažejo kot najobetavnejši biooznačevalci za napovedne modele odziva na adalimumab geni ATG16L1, ATG5, IL23R, CRP, S100A8/9, NFKB1, ECM1, HFE in FCGR2C. Vključenost dodatnega lokusa ELOVL7/MMD v (ne)odzivnost na adalimumab smo odkrili z integracijo podatkov genomike (variabilnosti v DNA-zapisu) in transkriptomike (izražanje genov oz. aktivnost genov) v krvi, vključenost dodatnih genov MACF1, CTSE, HDLBP, HSPA9, HLA-DMB, TAP2, LGMN, ANAPC11, ACP5 pa s transkriptomom v črevesni biopsiji. Z analizo izražanja genov v črevesnih biopsijah in metodami strojnega učenja smo dosegli več kot 90,5 % napovedno zanesljivost. Z uporabo funkcionalnih celičnih modelov smo odkrili vlogo gena IL1B in procesa diferenciacije monocitov v makrofage v odzivu na adalimumab. Rezultati naših študij kažejo, da je odzivnost na biološka zdravila verjetno preveč kompleksna, da bi jo lahko napovedali s posameznimi genetskimi biooznačevalci, in da bo za učinkovito uporabo v klinični praksi potrebna integracija multi-omskih (genomika, transkriptomika, proteomika, epigenomika) in kliničnih podatkov ter uporaba naprednih računalniških algoritmov ter umetne inteligence. Izziv sedanjih raziskav so tudi dobro ciljane velike mednarodne multi-omske konzorcijske študij po vzoru genomskih/genetskih študij, ki so že pokazale uspeh pri dešifriranju genetske arhitekture KVČB. Naše trenutne študije so usmerjene tudi z uporabo najnovejše tehnologije za določitev celotnega transkriptoma v vsaki posamezni celici (scRNAseq), ki obetajo boljše razumevanje molekularnega mehanizma neodzivnosti in bodo v veliko pomoč pri ugotovitvi zanesljivih biooznačevalcev za personalizirano medicino in molekularnih tarč za nova zdravila.

Prof. dr. Alojz Ihan, dr. med., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, alojz.ihan@mf.uni-lj.si